重組海藻糖合成酶表現於 E.coli 生產海藻糖與其固定化酵素探討

學生姓名: 黃鈺婷
指導教授: 方翠筠
學　　號: 10332012
學期: 104上
摘　　要: 海藻糖是由兩個葡萄糖分子以 α-1,1 鍵結形成的非還原性雙糖，其廣泛存在於自然界中。目前，海藻糖廣泛應用於各領域，如食品的甜味劑、植物的抗凍劑、化妝品內的保濕成分及臨床的穩定劑等。海藻糖可由生物體萃取、微生物發酵、化學合成、基因遺傳工程技術及酵素轉換法等方式生產。酵素轉換法包括三種酵素途徑：磷酸水解酶系統、糖苷轉移酶-水解酶系統以及海藻糖合成酶系統。本次研究主要使用海藻糖合成酶系統，海藻糖合成酶 (trehalose synthase) 直接與麥芽糖之 α-1,4 糖苷鍵進行轉糖苷反應 (transglycosylation) 轉變為 α-1,1 糖苷鍵的海藻糖，此法僅需一個步驟即可將麥芽糖轉換為海藻糖，然而酵素無法回收再利用因此較不利於工業上生產，有研究指出可將酵素進行固定化後可重複生產海藻糖。本報告目的為將 Picrophilus torridus 來源之海藻糖合成酶 (PTTS) 表現於 E.coli 中，提升其表現量並探討固定化條件，最終應用於海藻糖的生產。研究結果得知 PTTS 表現於 E.coli 中，利用融合 EM7 promoter 於 argU 與 ileX 的 tRNA 序列與減少不可溶物質生成，可增加酵素的表現量。以米作為原料生產海藻糖，綜合成本與海藻糖產率，最適生產條件為乾磨法處理原料、反應溫度為 50℃、海藻糖合成酶用量為 3.5 U/g maltose 且反應時間為 22 小時，可得到 50% 以上之海藻糖。固定化方面，將 PTTS 以 DIAION® CR11 載體進行固定化，固定化後酵素最適作用 pH 值、最適作用溫度與熱穩定皆與未固定前相似，然而固定化後酵素經過 24 次反應後固定化酵素仍有 80% 以上的活性，表示固定化酵素可重複利用於海藻糖的生產。