使用枯草桿菌表現胞外龍膽石斑魚之第一型干擾素

學生姓名: 林聖博
指導教授: 林泓廷
學　　號: 10332006
學期: 104下
摘　　要: 台灣石斑魚養殖產量佔全球 23%，龍膽石斑 (Epinephelus lanceolatus) 為高經濟魚種，近年來因疾病爆發使產值無法提升，其中神經壞死病毒 (nervousnecrosis virus, NNV) 為感染主因。石斑魚可使用第一型干擾素 (interferon, IFN)作為抗病毒的免疫因子，然而魚苗的免疫系統尚未成熟無法抵禦 NNV 使致死率達 99%，且 NNV 常見於飼料、養殖池、運輸載具中難以完全去除，目前預防治療以魚體注射疫苗為主造成成本居高不下。枯草桿菌具備益生菌潛力，若蛋白質前端有訊息胜肽 (signal peptide, SP) 也可將產物分泌至胞外。本篇期許利用基因技術將龍膽石斑 IFN 表現於胞外，相較使用大腸桿菌可節省純化蛋白的時間及成本。以質體 pET26b-ifn 為模板擴增目標基因 ifn，與枯草桿菌表現質體 pHT254進行接合建構 pHT254-ifn，為了進行胞外表現，再以 RF-cloning 插入 SP AmyE及 SacB 建構出 pHT254-AmyE-ifn 及 pHT254-SacB-ifn 兩質體以探討 SP 對蛋白表現的影響，質體以電穿孔方式送入表現菌株 Bacillus subtilis WB800N 進行蛋白質表現，經鎳離子親和性管柱與 FPLC (Fast protein liquid chromatography) 純化蛋白後以 SDS-PAGE 確認蛋白質分子量是否為 18 kD，並做蛋白質物種鑑定確認物種，同時探討誘導濃度、誘導時間對產量影響，結果顯示誘導劑量無顯著差異，誘導時間 18 小時較佳。以 Bradford assay 測定蛋白質產量，SacB-IFN 產率為1.2 mg/L，而 AmyE-IFN 則未有產率。使用龍膽石斑魚頭腎細胞株 G11 進行毒性測試，確認 SacB-IFN 小於 2 μg/μl 不具細胞毒性。後續將探討 IFN 是否可以增加 G11 的抗病毒活性，以驗證本篇實驗生產的 IFN 可作為魚類的抗病毒研究成果進程之一。