摘要
近幾年來，針對許多海洋雙殼貝類的藥理作用的研究發現，許多貝類具有抗腫瘤、抗肝炎的生理活性，但文蛤中有效成份卻鮮少被發現，其保肝的物質及相關機制也不甚明確，缺乏科學印證。本研究目的為文蛤萃取物抗肝炎有效物質之分離純化、文蛤中有效物質之化學結構鑑定、S9 的保肝篩選模式建立。研究結果發現不論在 S9 fraction 與 microsomes 保肝篩選模式中，文蛤與黃金蜆之粗萃取物皆具有明顯抑制 CCl4 誘導之脂質過氧化作用之保肝功效，而黃金蜆以 EA 層粗萃物之抑制效果最佳。標準品檢測方面，silymarin 之 IC50 為 16.67 μM/mL；quercetin 之 IC50 為 33.34 μM/mL；rutin 之 IC50 為 97.67 μM/mL；catechin 之 IC50 為 41.88 μM/mL；glycyrrhizin 之 IC50 為 18.74 μM/mL。其中Silymarin 之 IC50 比起其他種類的黃酮類來的低許多，顯示其對四氯化碳所誘導之化學性肝損傷的確具有其抑制效果；已知之抗氧化物 quercetin、rutin 作為對照其中 rutin 之抑制效果皆明顯低於 quercetin，顯示 microsomes 與 S9 保肝模式之篩選結果一致。而文蛤分離純化物 WSY-22 依其NMR 與 UV 圖譜來推測其結構。

Abstract

Recently, many researches have revealed that marine shellfish extracts have biological properties, such as antitumor and antihepatitis. However, the bioactive component(s) in clam has not been studied widely. Although the hepatoprotective activities of clam extracts have been studied, the bioactive components have not yet been identified. The aim of the this research is to isolate and purify antihepatitis substance from clam extraction to study liver-protective screening model employing S9 fraction as cytochrome P450 source.
The results showed that using S9 fraction or microsomes as hepatoprotective screening model, Meretrix lusoria and Corbicula fluminea crude extracts possessed significant inhibitory effects against CCl4-induced lipid peroxidation. The ethyl acetate extracts of Corbicula fluminea showed the highest inhibition.
The inhibitory effects against CCl4-induced lipid peroxidation (IC50) of silymarine, quercetin, rutin, catechine, and glycyrrhizin were 16.67, 33.34, 97.67, 41.88, and 18.64 �嵱/mL, respectively. Comparing known antioxidants such as quercetin and rutin, the inhibitory activities of rutin were significantly lower than quercetin. The results were consistent no mater employing microsome or S9 fraction for hepatoprotective screening models. WSY-22, a partially purified bioactive substance from clam based on NMR and UV spectra.

目 錄
壹、緒論 16
有關文蛤 16
研究目的 17
貳、文獻整理 18
(一) 文蛤的藥理作用及其相關研究 18
(二) 文蛤中之有效化學成分 19
(三) 肝臟的代謝 21
(四) 保肝功能評估方法 22
(五) Silymarin 23
(六) 藥物動力學 26
1. 藥物的生物轉移作用 (Drug biotransformation) 26
2. 肝臟中的 Phase I enzymes 27
3. 肝臟中的 Phase II enzymes 28
(七) 四氯化碳 (CCl4) 29
(1) 環境中的四氯化碳 29
(2) 肝臟中的四氯化碳 31
(3) 四氯化碳及其應用 34
(八) ㄧ般藥物的篩檢模式 37
1. Liver microsomes 及其應用 37
2. S9 fractions 及其應用 40
(九) TBARS 與 S9 41
(十) 保肝模式原理架構 42
叄、實驗材料 44
ㄧ、材料 45
三、儀器設備 46
肆、實驗方法 48
伍、實驗步驟與流程 52
ㄧ、文蛤之萃取 52
二、文蛤萃取物之分離與純度鑑定 54
三、文蛤粗萃物之初步 TLC 分析 55
四、保肝模式之建立 56
(一) MDA 標準曲線的製作 56
(二) CYP2E1 之酵素活性測定 58
(三) Microsomes 保肝模式與 S9 保肝模式之建立 59
(四) 保肝篩選 61
(五) 文蛤各層粗萃物之分離純化 63
(六) WSY fractions 之分離純化 65
(七) WSY-4~ WSY -7 fractions 之分離純化 66
(八) WSY-13 fractions 之純化 67
(九) WSY-13 fractions 之分離與 RP-HPLC 純度分析 68
(十) WSY-18 及 WSY-19 fractions 之製備型管柱分離純化 68
(十ㄧ) WSY-20之製備型管柱分離純化 69
陸、實驗結果與討論 71
(一) 標準曲線 71
(二) CYP2E1 酵素活性之比較 72
(三) Microsomes 保肝模式之最佳條件 72
(四) S9 保肝模式之最佳條件 73
(五) S9 保肝模式與 microsomes 保肝模式之比較 75
(六) 文蛤粗萃物與黃金蜆粗萃物之 S9 保肝篩選 75
(七) 文蛤粗萃物與黃金蜆粗萃物之 microsomes 保肝篩選 77
(八) 標準品之 S9 保肝篩選 79
(九) 各標準品之S9 保肝篩選之半抑制濃度之計算 81
(十) 各標準品之S9 保肝篩選之半抑制濃度之比較 83
(十ㄧ) 已知之抗氧化物之 microsomes 保肝篩選 83
(十二) 文蛤各層粗萃物之 microsomes 保肝篩選 90
(十三) WSY fractions 之分離純化與 microsomes 保肝篩選 90
(十四) WSY-4~WSY-7 fractions之分離純化與microsomes 保肝篩選 94
(十五) WSY-13 fractions 之純化與 RP-HPLC 結果 97
(十六) WSY-13 fractions 之分離 RP-HPLC 純度分析 99
(十七) WSY-18 及 WSY-19 fractions 之製備型管柱分離純化與microsomes 保肝篩選 100
(十八) WSY-20 之RP-HPLC 的純度檢測 103
(十九) WSY-20 之RP-HPLC 的分離純化 105
(二十) WSY-22 之RP-HPLC 的純度檢測 107
(二十ㄧ) WSY-22 之結構鑑定 109
柒、結論 111
捌、參考文獻 113

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