L-精胺酸脫亞胺酶之純化與特性探討
學生姓名:
黃培騏
指導教授:
方翠筠
學期:
112下
摘 要:
L-瓜胺酸於醫療保健產業具不可忽視的商業價值，L-精胺酸脫亞胺酶（L13 arginine deiminase，ADI，EC 3.5.3.6）不可逆地可催化精胺酸(arginine)水解為氨和L-瓜胺酸(citrulline)；據臨床研究證明，ADI為有前景的抗癌酵素，故對ADI的酶促生物合成研究有其價值。自產黃青黴菌 (Penicillium chrysogenum)以 85%硫酸銨(ammonium sulfate)、DEAE-纖維素(二乙基氨基乙基纖維素)和 Sephadex G200中純化ADI (PE-ADI)後，其純化率為17.2倍、產率為4.6%、比活性則為50 Umg−1 protein，而分子量為49 kDa，而PE-ADI在最適溫度40°C及最適pH 6.0時表現出最大活性。自奧氏嗜熱鹽絲菌 (Halothermothrix orenii) 之 ADI(H-ADI) 在大腸桿菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中表達，在55°C，pH 6.5下比活性為91.8 Umg-1 protein；在45°C下熱處理180分鐘後，此酵素的相對活性仍保持在74%，但在50°C下則僅剩25%，其熔點為56°C。H-ADI並不是一種需要金屬的酵素，添加了Ni 23 2+僅略微提高催化活性。精胺酸的Km和Vmax分別為55.5 mM和156.8 µmol/min/mg protein。另透過丙胺
酸掃描突變(alanine-scanning mutagenesis)分析後，發現三個殘基（Arg183、 Arg237和His273）是L-瓜胺酸形成的關鍵。最終在50℃下進行酵素合成產生出L-瓜胺酸，其轉化率高達99.03%。自戀臭假單胞菌（Pseudomonas putida）以硫酸銨沉澱、陰離子交換和疏水性層析法純化精胺酸脫亞胺酶(PS-ADI)。該酵素對硫醇結合金屬離子、作用於巰基的化學物質及多數界面活性劑表現出高敏感性。L-精胺酸類似物中，刀豆胺酸(Canavanine)對ADI的親和力最高，其次是D-精胺酸和胍(guanidine)。刀豆氨酸及D-精胺酸各在最低及最高測試濃度 (10 mM及200 mM) 時之ADI 活性分別降低至50%及至〜4%。L-精胺酸與殘基Asn160、Asp166、Arg185、Arg243、Asp280和Gln399形成的強氫鍵在D-精胺酸和刀豆胺酸中被保留，因此也對PS-ADI 具較高親和力。
酸掃描突變(alanine-scanning mutagenesis)分析後，發現三個殘基（Arg183、 Arg237和His273）是L-瓜胺酸形成的關鍵。最終在50℃下進行酵素合成產生出L-瓜胺酸，其轉化率高達99.03%。自戀臭假單胞菌（Pseudomonas putida）以硫酸銨沉澱、陰離子交換和疏水性層析法純化精胺酸脫亞胺酶(PS-ADI)。該酵素對硫醇結合金屬離子、作用於巰基的化學物質及多數界面活性劑表現出高敏感性。L-精胺酸類似物中，刀豆胺酸(Canavanine)對ADI的親和力最高，其次是D-精胺酸和胍(guanidine)。刀豆氨酸及D-精胺酸各在最低及最高測試濃度 (10 mM及200 mM) 時之ADI 活性分別降低至50%及至〜4%。L-精胺酸與殘基Asn160、Asp166、Arg185、Arg243、Asp280和Gln399形成的強氫鍵在D-精胺酸和刀豆胺酸中被保留，因此也對PS-ADI 具較高親和力。
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