探討使用 SpyTag/SpyCatcher 環化半胱胺酸-S-共軛 β-裂解酶對於活性及產生含硫香氣的影響
學生姓名:
黃乙淇
指導教授:
林泓廷
學 期:
113下
摘 要:
葡萄酒中較常被研究的化合物為 3-Mercapto-1-hexanol (3-MH), 3-Mercaptohexyl acetate (3-MHA) 及 4-Mercapto-4-methylpentan-2-one (4-MMP),賦予葡萄柚、百香果、黃楊木與黑醋栗的香氣,以半胱胺酸化前驅物存在於葡萄汁中。本實驗透過半胱胺酸14 S-共軛 β-裂解酶 (cysteine-S-conjugate β-lyase, CBL) 生產揮發性香氣化合物,也為了朝向酵素工業化邁進,選擇無載體固定化方式改善酵素本身不穩定等缺點,將目標基因合成SpyTag/SpyCatcher片段使CBL環化。本研究成功利用Escherichia coli C43 (DE3)表現來自海洋菌 Shewanella putrefaciens 之線性及含有 SpyTag/SpyCatcher 片段環化的半胱胺酸-S-共軛 β-裂解酶基因 (metC),並產生具有裂解 Cβ–Sγ 位之酵素 (MetC),使用粒徑排阻層析法解釋酵素為四聚體型態,使用 Ellman’s reagent 測試蛋白質活性,在最適反應條件上,線性酵素 (L-MetC) 為 pH 9, 42°C;環化酵素 (C-MetC) 為 pH 10, 37°C,進一步探討透過酵素轉化對基質特異性與釋放含硫香氣化合物之潛力以及環化的影響。根據酵素動力學結果證實 L-MetC 及 C-MetC 對多種半胱胺酸-S-共軛物具有催化活性,其中 L-MetC (𝐾𝑐𝑎𝑡/𝑘0.5 = 5.4 × 104 M-1s-1) 及 C-MetC (𝐾𝑐𝑎𝑡/𝑘0.5= 3.6 × 104M-1s-1 ) 對於酮類前驅物 Cys-4MMP 具有最佳的降解結果。為了符合工業化生產目的,選擇前驅物 Cys-4MMP 進行小規模試產香氣化合物,經 SPME-GC-MS 偵測發現在鹼性的反應環境中有副產物 mesityl oxide 的產生,將產物及副產物回收後計算總轉換率達 60%,也確認此酵素的 total turnover number (TTN) 為 3.6 × 10 4,已達酵素催化上限。綜上所述,利用 E. coli C43 (DE3) 重組成功表現 L-MetC 及 C-MetC 兩種具功能之酵素,除了具有釋放含硫香氣化合物之潛力,也能以小規模嘗試生產並具有高轉化率,期望未來能提供香料工業一項具前瞻性的研究。