探討藻膽蛋白之 DNA 序列分析與其蛋白特性
學生姓名:
何柏彣
指導教授:
林泓廷
學 號:
10432014
學期:
104下
摘 要:
藻膽蛋白 (phycobiliprotein, PBP) 為水溶性螢光蛋白，普遍存在於紅藻、綠藻、隱藻之中，其中包含藻紅蛋白 (phycoerythrin, PE)、藻藍蛋白 (phycocyain, PC)、別藻藍蛋白 (allophycocyanin,APC) 等藻膽色素，在藻類之中扮演重要的電子傳遞鏈角色。水溶性及具螢光特性使藻膽蛋白研究日益重要。基因水平轉移 (Horizontal gene transfer, HGT) 為將不同親代但相近物種之基因水平轉殖技術，利用 HGT 方法探討 Planktothrix 藻株間基因轉殖之可能性，選用八種藻株，其中四株為紅藻而四株為綠藻，所有藻株的基因具高度相似性，COG 比例介於 65-67 %，基因大小則介於 5.49-5.71 Mb，而相同化學型 (chemotype) 藻株之間更為接近。藻紅蛋白的操縱子為 19.7-kb且帶有 20 種蛋白基因訊息，藻紅蛋白操縱子的斷點在 cpcBA 303 以及 CHAP 13 的位置上，因此判斷具有 HGT 之潛力。有鑑於環境藻類的監控，以藻膽蛋白為生物標記透過吸光值及螢光偵測比對標準品進行定量分析；各標準品 PC 取 5 mg；APC 取 5 mg；PE 取 10 mg 分別將濃度調至: 21.2 與 25.1；22.1 與 23.8；20 mg/cm-3，並在定量分析中分別在 Synechococcus sp. 及 N. spumigena. 中得到 0.79 μg cm−3 和 20.22 μg cm−3 結果，比對標準品曲線與萃取物吸光值與螢光測定依此定量未知樣品，依此分析方法使藻膽色素作為生物標記，監控沿海地區具有前瞻性。藻紅蛋白中 γ 次單元連接 (αβ)3 之結構，具有兩種連接方式，依此推論具兩種 γ 次單元，配合三階段的純化最終可以得到 R-PE 純度 A566/A280 為 5.26 ，透過 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 及 IEF (Isoelectric focusing) 分析確認兩種 γ 次單元，分子量分別為 31.6 kD 及 34.6 kD，其 pI 值介於 7.6 到 8.1 之間，依此研究增進 PE 桿狀結構域蛋白組合體 (rod domainassembly) 在藻膽蛋白中之總量分析。藻膽蛋白利用基因工程配合 HGT 方法進行基因修飾與轉殖，並配合吸光測定及螢光測定做初步定量並篩選適當藻株進行次單元分析，以三步純化次單元進行分析，次單元蛋白質內部序列最終可與 DNA 序列進行比對驗證。
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