探討不同親和性標籤對蛋白質表現、特性及純化之影響探討不同親和性標籤對蛋白質表現、特性及純化之影響
學生姓名:
張浩秦
指導教授:
蔡國珍
學期:
109上
摘 要:
本篇報告主要針對不同蛋白質親和性標籤 (affinity tag) 的特性及純化條件進行探討，進而達到提升純化效率與品質的目的。短鏈多肽 Car9 與二氧化矽 (silica)間具高度親和性，能透過矽衍生化管柱結合含有 Car9 序列的目標蛋白，並在 pH8.25 的條件下使用 0.5M 離胺酸進行沖提，可取得純度高達 98%的樣品，過程中加入 10％甘油或 0.3% Tween 20 能有效抑制宿主蛋白的非特異性結合，但在變性環境中，蛋白質則無法與管柱結合。使用 TEV 蛋白酶不須經由透析去除溶液中殘留的離胺酸即可針對含有 TEV 蛋白酶識別序列進行剪切，即可達到將親和性標籤與目標蛋白分離的目的。Marinobacter hydrocarbonoclasticus 中 PA14 蛋白質域(MhPA14)，對於葡萄糖殘基具有專一的親和性，能與 Superdex 200、Sephadex G100及 Sephacryl 200 等樹脂結合並以 EDTA 或葡萄糖進行沖提，針對綠螢光蛋白 (GFP)與冰結合蛋白 (Marinomonas primoryensis ice-binding protein, MpIBD) 進行純化，MhPA14 相較於組胺酸標籤有較佳的純化結果。鈣調蛋白 (calmodulin, CaM) 是一種構型及疏水性會隨著環境中鈣離子濃度改變而改變的蛋白質，在含有 5 mM 鈣離子的情況下 CaM 能與 CaM-binding domain 1 (CBD1)或苯基瓊脂糖凝膠管柱相互結合，藉此透過兩階段的純化策略純化 GFP 等目標蛋白。綜合上述結果，於純化重組蛋白時挑選適合之親和性標籤並應用適當的純化策略，能夠有效降低粗萃取液中雜蛋白之干擾，以增加純化之效率及有效降低生產成本。
摘要_張浩秦_10932001.pdf